Denaturasi, Renaturasi, dan Perbaikan DNA

Denaturasi  DNA

Denaturasi adalah untai ganda molekul DNA yang dapat dipisahkan dengan perlakuan suhu maupun senyawa alkali sehingga konformasinya berubah dan dapat hampir menjadi acak. Tingkat denaturasi DNA tergantung pada tingginya suhu. Perubahan tingkat denaturasi DNA dapat diikuti dengan memperlakukan DNA pada suhu yang bertingkat, kemudian diukur absorbansinya (A) pada panjang gelombang 260. Perlu diketahui bahwa basa asam nukleat menyerap dengan kuat cahaya pada panjang gelombang 260. Kurva hubungan antara peningkatan suhu dengan suhu dengan nilai A₂₆₀ menunjukkan perubahan tingkat denaturasi DNA. Banyaknya cahaya dapat diserap oleh molekul DNA tergantung pada struktur molekulnya. Semakin teratur molekulnya maka semakin sedikit cahaya yang diserap. Oleh karena itu nukleotida bebas menyerap cahaya lebih besar daripada molekul DNA untai tunggal atau RNA. Nilai serapan cahaya oleh molekul DNA dengan struktur DNA tetapi dengan konsentrasi yang sama (50mg/ml) adalah sebagai berikut :

            DNA untai ganda A₂₆₀ = 1,0

            DNA untai tunggal A₂₆₀ = 1,37

            Nukleotida bebas A₂₆₀ = 1,60

Beberapa hal penting dalam kurva diatas antar lain :

1.      Nilai A₂₆₀ tidak berubah sampai keadaan suhu yang umumnya dijumpai pada sel hidup dialam.

2.      Peningkatan nilai A₂₆₀ terjadi dalam kisaran 6 sampai 8˚C.

3.      Nilai A₂₆₀ maksimum sekitar 37% lebih besar dibandingkan dengan nilai awalnya.

Aspek Fisiologis Denaturasi DNA

            Proses denaturasi DNA sebenarnya juga terjadi dalam kondisi fisiologis dan bahkan merupakan bagian dari proses fisiologis yang penting. DNA sebenarnya merupakan struktur yang dinamis. Bagian tertentu struktur gelembung untai tunggal. Fenomena ini disebut breathing. Dalam aktivitas fisiologis jasad hidup, keadaan semacam ini sangat penting artinya karena DNA dapat  berinteraksi dengan banyak protein, misalnya dalam proses replikasi dan transkripsi. Fenomena breathing lebih banyak terjadi pada bagian yang kandungan A T nya lebih tinggi. Dengan adanya breathing maka protein yang terlibat dalam proses replikasi dan transkripsi dapat  berinteraksi dengan molekul DNA.

Renaturasi DNA

Renaturasi adalah proses pembentukan kembali struktur untai ganda dari keadaan terdenaturasi. Renaturasi merupakan suatu proses yang dapat terjadi secara in vivo maupun in vitro. Renaturasi in vitro merupakan suatu fenomena yang sangat berguna untuk analisis molekuler, misalnya untuk mengetahui kesamaan atau kedekatan genetis antara suatu organisme dengan organisme lain, untuk mendeteksi macam RNA tertentu, untuk mengetahui apakah suatu urutan nukleutida tertentu ada lebih dari satu pada suatu jasad, serta untuk mengetahui lokasi spesifik suatu urutan nukleutida pada genom . Dalam bagian ini merupakan proses renaturasi secara in vitro.

            Tahapan renaturasi :

1.      Untai tunggal DNA (sense) bertemu dengan untai tunggal lainnya (antisense) secara acak

2.      Jika urutan Nukleotida kedua untai tunggal tersebut komplementer, maka akan terjadi ikatan hidrogen dan terbentuk struktur untai ganda pada suatu bagian. Pembentukan ikatan hidrogen kemudian akan dilanjutkan pada bagian yang lain secara cepat sehingga terbentuk struktur untai ganda yang lengkap

Tahapan yang menentukan kecepatan renaturasi bukan proses pembentukan untai gandanya melainkan proses tumbukan antara molekul untai tunggal dengan untai tunggal yang lain. Renaturasi dipengaruhi oleh hambatan friksional. Proses ini berlangsung secara acak sehingga sangat ditentukan oleh konsentrasi DNA.

Syarat Renaturasi

1. Konsentrasi garam cukup tinggi (0,15 sampai 0,5 M). Ion Na+ yang bersifat positif akan menetralkan gugus fosfat DNA yang bermuata negatif sehingga tidak terjadi saling tolak antar untaian DNA yang satu dengan untaian DNA yang lain.
2. Suhu renaturasi harus cukup tinggi (20 sampai 25˚C dibawah nilai Tm).
3. Konsentrasi DNA, semakin tinggi konsentrasinya maka probabilitas tumbukan antar molekul untai tunggal DNA menjadi semakin besar.
4. Kecepatan perlakuan renaturasi. Jika suatu molekul DNA didenaturasi dengan perlakuan suhu tinggi kemudian suhunya diturunkan secara cepat, maka probabilitas molekul DNA sense untuk berpasangan dengan molekul antisense secara akurat akan lebih kecil. Oleh karena itu proses renaturasi biasanya dilakukan dengan menurunkan suhunya secara bertahap.

Perbaikan DNA

DNA sebagai materi genetic yang selalu mengalami berbagai reaksi kimia dan selalu melakukan kopi DNA. Perubahan struktur DNA ini disebut mutasi DNA yang dapat terjadi pada saat proses replikasi DNA. Untuk menstabilkan hal tersebut maka DNA memiliki kemampuan untuk memperbaiki (repair) kesalahan yang terjadi pada dirinya sendiri. Jika mutasi DNA yang terjadi cukup banyak dan DNA tidak sempat untuk memperbaiki (repair) dirinya sendiri maka akan terjadi kelainan ekspresi genetic bahkan menyebabkan terjadinya penyakit genetik. Konsumsi makanan yang bergizi serta istirahat yang cukup memungkinkan tubuh untuk dapat melakukan repair DNA.

DNA repair merupakan suatu mekanisme perbaikan DNA yang mengalami kerusakan / kesalahan yang diakibatkan oleh proses metabolisme yang tidak normal, radiasi dengan sinar UV, radiasi ion, radiasi dengan bahan kimia, atau karena adanya kesalahan dalam replikasi DNA. Mekanisme perbaikan yang terdapat ditingkat selular secara garis besar disesuaikan dengan jenis kerusakan yang tentu saja terkait erat dengan jenis factor penyebabnya. Sel-sel menggunakan mekanisme-mekanisme perbaikan DNA untuk memperbaiki kesalahan-kesalahan pada sekuens basa molekul DNA. Kesalahan dapat terjadi saat aktivitas selular normal, ataupun dinduksi. DNA merupakan sasaran untuk berbagai kerusakan: baik eksternal agent maupun secara spontan.

Apabila ada kesalahan / kerusakan DNA, sel mempunyai dua pilihan :

1. Kesalahan tersebut diperbaiki dengan cara mengaktifkan DNA repair. Namun apabila kesalahan yang ada sudah tidak mampu lagi ditanggulangi, sel memutuskan untuk beralih ke pilihan kedua.
2. Apabila DNA tidak mampu diperbaiki lagi, akibat dari adanya kesalahan yang fatal maka akan  dimatikan daripada hidup membawa pengaruh yang buruk bagi lingkungan sekelilingnya. Kemudian sel dengan DNA yang normal akan meneruskan perjalanan untuk melengkapi siklus yang tersisa yaitu S (sintesis) G2 (Gap 2) dan M (Mitosis).

Proses perbaikan DNA itu harus melibatkan berbagai macam komponen, yang sangat berperan penting dalam mekanisme perbaikan DNA tersebut. Komponen-komponen yang terlibat dalam mekanisme perbaikan DNA dapat dijelaskan secara rinci pada penjelasan berikut ini.

Komponen yang Terlibat dalam Proses DNA Repair

Repair system	Enzim/protein	Repair sistem	Enzim/protein
Base excision	DNA glycosylase	Mismatch	Dam metilase
	AP Endonuklease		MutS,MutL,MutH
	DNA Polymerase I		Exonuclease
	DNA ligase		DNA Helicase II
Nucleotid exicion	UVrA,UVrB,UVrC		SSB Protein
	DNA polymerase I		DNA plomerase III
	DNA Ligase		DNA Ligase

Mekanisme DNA repair

Pada dasarnya perbaikan DNA dapat dikelompokkan  menjadi 3 yaitu :

1. Demage reversal : penggantian secara langsung, photoreactivation merupakan cara perbaikan DNA dengan melibatkan pembuangan atau pembalikan DNA yang rusak oleh sebuah enzim tunggal yang tergantung oleh cahaya. Pada bakteri E. Coli enzim itu dikodekan oleh gen phr. Adanya kerusakan pada suatu segmen pirimidin (timin dan sitosin) yang telah berpasangan (dimer) pada suatu struktur DNA, akan mengaktifkan suatu proses perbaikan dimana suatu kompleks protein enzim fotoreaktif akan memutuskan ikatan hydrogen tetapi tanpa memutuskan ikatan fosfodiester antar nukleotida. Perubahan urutan akan diperbaiki dengan pergantian sesame nukleotida dengan basa pirimidin, dan akan diikuti proses penangkupan kembali celah yang semula tercipta.
2. Demage removal : proses ini lebih kompleks karena melibatkan replacing atau penggantian dengan dipotong-potong. Pada excision repair diawali dengan proses pengidentifikasian ketidaksesuaian sekuen / urutan DNA dalam suatu proses pengawasan yang dilakukan oleh endonuklease perbaikan DNA. Kompleks enzim tersebut akan menginisiasi proses pemisahan DNA heliks utas ganda menjadi suatu segmen utas tunggal. Proses ini akan diakhiri dengan pertautan kembali antara dua utas tunggal tersebut untuk kembali menjadi bagian dari heliks utas ganda, dengan perantaraan enzim DNA ligase.
3. Demage tolerance : Mentoleransi kesalahan.Hal ini dilakukan bila kesalahan tidak dapat diperbaiki sehingga kesalahan terpaksa ditoleransi dan yang terotong adalah kedua strand. Mekanisme ini adalah sebentuk replikasi rawan kesalahan (error-phone) yang memprbaiki kerusakan-kerusakan pada DNA tanpa mengembalikan sekuens basa awal. Tipe perbaikan ini bisa dipicu oleh kerusakan DNA dalam tingkat tinggi. Pada bakteri E. Coli, system tersebut diatur oleh gen-gen recA dan umu yang dihipotesiskan mengubah fidelitas (ketepatan) polymerase DNA setempat. Dalam rose situ, polymerase melakukan replikasi melewati kerusakan DNA, sehingga memungkinkan sel untuk bertahan hidup atau sintas. Jika sel tersebut berhasil sintas melalui seluruh kerusakan DNA, besar kemungkinan sel itu mengandung satu atau lebih mutasi.

Ada 3 tipe demage removal yaitu :

a. Base excision repair, hanya 1 basa yang rusak dan digantikan dengan yang lain. Basa-basa DNA dapat dirusak melalui deaminasi. Tempat kerusakan basa tersebut dinamakan dengan”Abasic site” atau “AP site”. Pada E.coli enzim DNA glycosilase dapat mengenal AP site dan membuang basanya. Kemudian AP endonuklease membuang AP site dan Nukleotida sekitarnya. Kekosongan akan diisi dengan bantuan DNA Polymerase I dan DNA Ligase. DNA polymerase I berperan didalam mensintesis atau menambahkan pasangan basa yang sesuai dengan pasangannya.sedangkan DNA Ligase berperan dalam menyambungkan pasangan basa yang telah disintesis oleh DNA polymerase I.

Base Excision Repair

            b. Nucleotide excision repair, adalah  memotong pada  bagian / salah  satu  segmen DNA, dari DNA yang  mengalami kerusakan. Kerusakan nukleotida yang disebabkan oleh sinar UV, sehingga terjadi kesalahan pirimidin dimer (kesalahan dua basa tetangga). Pada E. Coli terdapat protein yang terlibat dalam proses pembuangan atau pemotongan DNA yang mengalami kerusakan, protein tersebut adalah UVrA, UVrB, UVrC, setelah protein tersebut mengenali kesalahan, maka nukleotida yang rusak tersebut dihilangkan (dipotong) sehingga terjadi kekosongan pada segmen untaian nukleotida tersebut. Selanjutnya untuk mengisi kekosongan tersebut maka RNA polymerase I mensintesis nukleotida yang baru untuk dipasangkan pada segmen DNA yang mengalami kekosongan tadi, tentu saja dengan bekerja sama dengan DNA ligase dalam proses penyambungan segmen DNA tersebut.

Nucleotide Excision Repair

c. Mismatch repair. Pada tahap ini yaitu memperbaiki kesalahan-kesalahan yang terjadi ketika DNA disalin. Selama replikasi DNA, DNA polymerase sendirilah yang melakukan perbaikan salah pasang. Polimerase ini mengoreksi setiap nukleotida terhadap cetakannya begitu nukleotida ditambahkan pada untaian. Dalam rangka mencari nukleotida yang pasangannya tidak benar, polymerase memindahkan nukleotida tersebut kemudian melanjutkan kembali sintesis, (tindakan ini mirip dengan mengoreksi kesalahan pada pengolah kata dengan menggunakan tombol “delete” dan kemudian menuliskan kata yang benar). Protein-protein lain selain DNA polymerase juga melakukan perbaikan salah pasang. Para peneliti mempertegas pentingnya protein-protein tersebut ketika mereka menemukan bahwa suatu cacat herediter pada salah satu dari protein-protein ini terkait dengan salah satu bentuk   dari kanker usus besar. Rupanya cacat ini mengakibatkan kesalahan penyebab kanker  yang berakumulasi di dalam DNA. Pada intinya mekanisme perbaikan mismatch ini mendeteksi terlebih dahulu pasangan basa yang tidak “cocok (matched)” atau tidak berpasangan dengan benar. Kesalahan berpasangan basa atau mismatch dapat terjadi saat replikasi ataupun rekombinasi DNA, dimana untuk memperbaiki basa yang tidak berpasangan, terlebih dahulu harus diketahui pasangan basa mana yang mengalami kesalahan basa pada untai DNA. Caranya segmen DNA yang membawa basa yang salah dibuang, sehingga terdapat celah (gap) di dalam untai DNA. Selanjutnya dengan bantuan enzim polymerase celah ini akan diisi oleh segmen baru yang membawa basa yang telah diperbaiki, yang kemudian dilekatkan dengan bantuan enzim ligase.

                                                           

Mismatch Repair